3 小结与讨论

 

　　通过对中华皮蝇幼虫中纯化的LDH研究表明，中华皮蝇LDH为单体结构，热稳定性强，对pH、HgCl2都不敏感，比一般动物来源的LDH稳定[3]。尿素和盐酸胍是典型的蛋白质变性剂，本试验结果显示，中华皮蝇LDH对尿素有一定的耐受性。即使是强变性剂盐酸胍，在0.5 mol/L条件下中华皮蝇LDH仍可保持约50%的活力，这进一步证实了LDH结构的稳定性。有研究表明，LDH经2 mol/L尿素处理2 min，肌肉来源的同工酶LDH5基本失去活性，但心脏来源的LDH1活力基本不受影响[9]。因此，中华皮蝇LDH在性质上可能更接近哺乳动物中的LDH1。SDS是一种强阴离子去污剂，能导致蛋白质变性。中华皮蝇LDH对SDS比较敏感，推测SDS能影响酶分子或活性中心的电荷分布，导致LDH构象变化（变性）从而显著影响其催化能力，这与已有报道相符[10]。SDS导致蛋白质变性的机制与尿素、盐酸胍不同。尿素和盐酸胍可破坏蛋白质分子中的氢键，也可能破坏蛋白质分子内部的疏水作用；而SDS中的疏水长链和带负电荷的硫酸根可分别作用于蛋白质分子内部的非极性基团和水分子，导致蛋白质变性。结合中华皮蝇LDH对pH不敏感[3]以及对尿素、盐酸胍较好的耐受性特征，推测疏水作用力在稳定中华皮蝇LDH空间结构中发挥了更重要的作用。

 

　　有关金属离子对酶活力的体外影响已经有非常多的报道。金属离子对有些酶是必需的，也可与酶蛋白的某些氨基酸残基结合，从而影响酶的活力。有研究表明，在0.5～2.5 mmol/L的浓度范围内，Fe3+、Cu2+、Ni2+和Co2+对LDH均有抑制作用，且抑制程度依次下降；试验还观察到，Co2+随着浓度升高对LDH的抑制作用反而下降，但遗憾的是试验没有分析更高浓度Co2+的作用[11]；而汪勋清等[12]报道，Zn2+、Ca2+对LDH活力无影响，Mn2+有抑制作用，而Cu2+、Mg2+在低浓度时有微弱的促进作用。本试验结果与上述报道存在一些差异，可能与LDH结构不同有关。另外，不同研究采用的二价金属离子浓度、LDH的纯度及方法等的差异也可能会导致不同的试验结果。

 

　　本研究中Co2+在3 mmol/L时对LDH活力有较强的促进作用。作为重金属的Co2+对很多酶都有抑制作用[5，11]，但也有不少酶需要Co2+或者可以被Co2+激活[13-16]，其机制可能涉及Co2+与酶的氨基酸残基结合，影响酶的构象或活性中心；或类似碱性羧肽酶中，Co2+代替Zn2+作为酶的辅助因子[15]。D-木糖异构酶为四聚体，每个亚基中都含有两个必需的金属离子（包括Co2+）结合位点（1个结构位点和1个催化位点）[14]。由此可见，Co2+对酶活力的影响及相关的机制可能十分复杂。LDH并非金属酶类，有关Co2+对LDH活力的促进作用的机制尚不清楚。已有报道表明，Co2+对其他来源LDH活力的影响不同于本研究结果[11，12]。因此，中华皮蝇LDH活力被高浓度Co2+显著促进的特点，可能是该单体酶的特性之一。

 

　　参考文献：

 

　　[1] BROWN W M， YOWELL C A， HOARD A， et al. Comparative structural analysis and kinetic properties of lactate dehydrogenases from the four species of human malarial parasites[J]. Biochemistry，2004，43（20）：6219-6229.

 

　　[2] MARCHAT L， LOISEAU P M， PETEK F， et al. Purification and characterization of lactate dehydrogenase isoenzymes 1 and 2 from Molinema dessetae （Nematoda：Filarioidea）[J]. Parasitol Res，1996，82（8）：672-680.

 

　　[3] LI P F， JIN S Y， HUANG L， et al. Purification and properties of a monomeric lactate dehydrogenase from yak Hypoderma sinense larva[J]. Exp Parasitol，2013，134（2）：190-194.

 

　　[4] MOUNAJI K， VLASSI M， ERRAISS N E， et al. In vitro effect of metal ions on the activity of two amphibian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases： potential metal binding sites[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2003，135（2）：241-254.

 

　　[5] WAI L，CHONG K， HO W S. Influence of heavy metals on Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interactions in Chironomus riparius larvae[J]. Environ Toxicol Chem，2013，32（8）：1882-1887.

 

　　[6] OTRANTO D， COLWELL D D， TRAVERSA D， et al. Species identification of Hypoderma affecting domestic and wild ruminants by morphological and molecular characterization[J]. Med Vet Entomol，2003，17（3）：316-325.

 

　　[7] 刘浩浩，李玉萍，黄志宏，等.牦牛牛皮蝇幼虫的快速PCR-RFLP鉴定[J].湖北农业科学，2012，51（7）：1477-1480.

 

　　[8] GUZIK U， HUPERT-KOCUREK K， SALEK K， et al. Influence of metal ions on bioremediation activity of protocatechuate 3，4-dioxygenase from Stenotrophomonas maltophilia KB2[J]. World J Microbiol Biotechnol，2013，29（2）：267-273.

 

　　[9] KARLSEN R L， N？覫RGAARD L， GULDBRANDSEN E B. A rapid method for the determination of urea stable lactate dehydrogenase on the 'Cobas Bio' centrifugal analyser[J]. Scand J Clin Lab Invest，1981，41（5）：513-516.

 

　　[10] SANFORD K J， MEYER D J， MATHISON M J， et al. Selective inactivation of lactate dehydrogenase isoenzymes with ionic surfactants[J]. Biochemistry，1981，20（11）：3207-3214.

 

　　[11] 蒋本国，刘长建，张 乐，等.金属离子对LDH的抑制作用与底物对其保护作用研究[J].高师理科学刊，2010，30（4）：80-83.

 

　　[12] 汪勋清，高小霞.二价金属离子影响乳酸脱氢酶活性的单扫伏安研究[J].高等学校化学学报，1998，19（4）：543-546.

 

　　[13] BRAUN T. The effect of divalent cations on bovine spermatozoal adenylate cyclase activity[J]. J Cyclic Nucleotide Res， 1975，1（6）：271-281.

 

　　[14] VAN BASTELAERE P B， CALLENS M， VANGRYSPERRE W A， et al. Binding characteristics of Mn2+， Co2+ and Mg2+ ions with several D-xylose isomerases[J]. Biochem J，1992，286（Pt3）：729-735.

 

　　[15] DEDDISH P A， SKIDGEL R A， ERDO S E G. Enhanced Co2+ activation and inhibitor binding of carboxypeptidase M at low pH. Similarity to carboxypeptidase H （enkephalin convertase）[J].Biochem J，1989，261（1）：289-291.

 

　　[16] OHSHIMA N，YAMASHITA S，TAKAHASHI N，et al.Escherichia coli cytosolic glycerophosphodiester phosphodiesterase （UgpQ） requires Mg2+，Co2+，or Mn2+ for its enzyme activity[J]. J Bacteriol，2008，190（4）：1219-1223.